Белки, связанные с ДНК эукариотов и отличающиеся от гистонов, называют негистоновыми хромосомными белками (НГБ). Они были открыты в 1946 г. Мирским и Поллистером . От ДНК их отделяют с помощью смеси 2 М NaCl и 5 М мочевины. К ним относятся белки, ответственные за экспрессию и репрессию генов хроматина, а также за метаболизм и модификации хромосомных белков . Они имеют изоэлектрические точки от 3,7 до 9,0. Эти белки весьма неоднородны по размеру - их молекулярная масса может составлять от ~8000 до нескольких сотен тысяч. Период полужизни НГБ сильно варьирует, но в целом он много короче, чем у гистонов. Как и гистоны, они синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядра, где образуют комплексы с ДНК . Если ввести НГБ в цитоплазму, они быстро проникают в ядра . Клетки с более высокой метаболической активностью содержат большее количество НГБ, и этим последние отличаются от гистонов, содержание которых одинаково в клетках всех типов. НГБ присутствуют в хроматине всех тканей, но структура их в разных тканях различна как в количественном, так и в качественном отношении, т. е. эти белки ткане- и видоспецифичны. С помощью методов с высоким разрешением показано, что в каждой ткани имеются сотни типов НГБ. В глиальных клетках с помощью изоэлектрофокусирования и микродиск-электрофореза было обнаружено почти 1500 НГБ . По всей вероятности, некоторые из них представляют собой модифицированные НГБ, причем они синтезируются в течение всего клеточного цикла, тогда как гистоны синтезируются только в S-фазе.

После обработки хроматина тимуса теленка 0,3 М NaCl НГБ по подвижности в геле делятся на две группы: высокоподвижная группа (HMG, от англ. high mobility group) с мол. массой менее 30000 и малоподвижная группа с мол. массой более 30000 . К HMG-белкам относятся четыре белка с большим зарядом: HMG 1 HMG 2 , HMG 14 и HMG 17 . Они включают 25 % основных и 30 % кислотных остатков и составляют только 3 % веса ДНК; они присутствуют во всех тканях и не являются тканеспецифичными . Белки HMG ассоциированы с нуклеосомой . Белки HMG 1 и HMG 2 имеют мол. массу около 26000. Они взаимодействуют с ДНК своими основными остатками . Около 50 % остатков HMG 1 заряжены. Необычным является то, что его COOH-концевая область содержит последовательность из 41 чередующихся остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Каждое ядро из тимуса теленка содержит ~10 6 молекул белков HMG 1 . По-видимому, белки HMG играют в хроматине структурную, а не регуляторную роль. Белок HMG 1 в отличие от трех остальных не содержит ароматических аминокислот. Он включает последовательность из 89 остатков и имеет мол. массу 9247. Его карбоксильный конец представляет собой цепь кислотных остатков, а NH 2 -конец - цепь основных остатков; центральная область богата остатками лизина. HMG 17 не имеет вторичной и третичной структуры, а по последовательности входящих в него аминокислотных остатков он гомологичен гистонам Н1 и Н5. Его уникальная первичная структура с цепями кислотных и основных остатков указывает на то, что он может быть структурным белком. Показано, что белок HMG 17 связывается приблизительно с 57 нуклеотидами ДНК из тимуса теленка и вызывает конформационные изменения в ДНК, сходные с теми, которые производит гистон Н1 , причем с ДНК связываются остатки с 15 по 40 .

Поскольку белки HMG имеют кислотные и основные остатки, образующие кластеры, они могут связываться с гистонами. своими кислотными группами, а с ДНК - основными остатками. Белки HMG 1 и HMG 2 ассоциированы с нуклеосомой . Они стабилизируют двойную спираль ДНК, поскольку при ассоциации с ними ее Т m увеличивается на 20 °C . Таким образом, имеются достаточные основания полагать, что белки HMG играют в хроматине структурную роль. При воздействии ДНКазы I на активную часть хроматина белки HMG удаляются. По-видимому, эти белки связаны с нуклеосомами . Дефер и др. также сообщают, что НГБ связаны с нуклеосомами. Существуют экспериментальные доказательства структурной роли некоторых НГБ . Метафазные хромосомы клеток HeLa сохраняют свою морфологию даже после того, как удалены все гистоны и большинство НГБ. Структура поддерживается лишь с помощью ~30 % НГБ, причем в их число входит около 30 типов НГБ с мол. массой ~75000. Каждая хроматида находится в спаренном состоянии, как в метафазе, и остается стабильной даже в 2 М NaCl. Установлено также, что после удаления гистонов из метафазных хромосом их общий размер уменьшается на 50 %, и это не приводит к заметным нарушениям в их морфологии . Отсюда следует, что НГБ ответственны за поддержание метафазной структуры хромосом, а, возможно, также и структур других фаз клеточного цикла. Есть сообщения , что НГБ участвуют в процессе закручивания ДНК в сверхспираль и в образовании структуры хроматина высшего порядка. В связи с этим было высказано предположение, что НГБ образуют "строительные леса", или каркас, определяя таким образом основную форму метафазной хромосомы , и в соответствии с этим каркасом ДНК сворачивается в петли.

НГБ очень неоднородны, число их велико, и некоторые из них ткане- и видоспецифичны. Общее содержание НГБ в разных тканях соответствует следующему ряду: мозг>печень>>почки>>селезенка>тимус . Некоторые НГБ специфичны для каждой ткани, а относительные количества индивидуальных НГБ варьируют от ткани к ткани. Они претерпевают количественные и качественные изменения при различных физиологических условиях, а также в процессе эмбриогенеза, дифференцировки клеток и клеточного цикла. Некоторые НГБ слабо связаны с ДНК и легко экстрагируются, другие связаны сильнее. Благодаря своим свойствам они участвуют в регуляции экспрессии генов в целом и в контроле транскрипции в частности . Показано , что фракция НГБ из печени крысы стимулирует транскрипцию in vitro. Когда НГБ добавляют к хроматину эмбриона морского ежа, увеличивается число участков инициации синтеза РНК . Аналогичные наблюдения сделаны на клетках асцитного рака Эрлиха: фракция слабо связанных НГБ избирательно ассоциирует с гомологичной ДНК и стимулирует транскрипцию специфических структурных генов в присутствии РНК-полимеразы эукариот . Удалось идентифицировать фосфорилированный НГБ с мол. массой 11000, который ингибирует инициацию транскрипции и играет регуляторную роль в экспрессии генов. Сообщалось также об участии в регуляции специфической активности генов сильно связанных НГБ . Катино и др. изолировали НГБ с мол. массой 31000, который в большом количестве содержится в неделящихся клетках, но в малом количестве - в делящихся, как, например, в гепатоме Новикова. Когда НГБ выделяли из хроматина с помощью 5 М мочевины (М 0), смеси 5 М мочевины и 1 М NaCl (M 1) и смеси 5 М мочевины и 3 М NaCl (M 3) и изучали роль каждой полученной фракции в транскрипции комплекса ДНК - гистон из печени кролика, оказалось, что функции этих трех фракций различны . Фракция М 0 стимулирует транскрипцию, связываясь с хроматином и изменяя общую конформацию комплекса ДНК - гистон. Фракция М 3 связывается более специфическим образом и раскрывает новые центры для связывания РНК-полимеразы. Фракция M 1 включает, по-видимому, структурные компоненты хроматина.

Метаболически более активные клетки содержат большее число НГБ. Обычно НГБ локализованы в тех областях хроматина, которые более активны в процессе синтеза РНК . НГБ способны прекращать репрессию матричной активности, вызываемую гистонами . Некоторые фосфорилированные НГБ специфически взаимодействуют с гистонами Н1 и Н2В и поэтому могут удалять их и открывать участки ДНК для транскрипции . НГБ способны переводить неактивные покоящиеся клетки, находящиеся в фазе G 0 , в активно растущие в стадии G 1 . В процессе этого перехода происходит синтез специфических типов НГБ и одновременно увеличивается матричная активность . Отсюда был сделан вывод, что эти белки участвуют в дерепрессии или в положительной регуляции экспрессии генов, особенно в контроле транскрипции в течение клеточного цикла.

При введении цыпленку эстрадиола или прогестерона синтез НГБ в яйцеводе стимулируется. НГБ в яйцеводе крыс, принимавших гормональные препараты, качественно отличны от белков контрольных животных . Полагают, что в ядре акцептором для прогестерон-рецепторного комплекса является НГБ. Глюкокортикоид-рецепторный комплекс лучше связывается с хроматином печени, чем с хроматином тимуса, простаты и матки. Если из хроматина удалить гистоны, то в оставшемся хроматине связывание комплекса увеличивается вдвое. Если же удалить все хромосомные белки, то связывание рецепторного комплекса глюкокортикоида с ДНК уменьшается на 50 %. Отсюда следует, что НГБ ответственны за связывание рецепторного комплекса гормона с ДНК . Синтез НГБ стимулируется кортизоном и глюкагоном . Стероидные гормоны, индуцирующие фосфорилирование НГБ в яйцеводе , а также кальцитонин и гормоны паращитовидной железы, которые оказывают противоположное действие на метаболизм кальция в костных клетках, стимулируют фосфорилирование различных НГБ .

Экдизон - стероидный гормон, ответственный за развитие насекомых - вызывает образование пуффов в хромосомах слюнных желез у личинок Sciara . Возникновение пуффа указывает на то, что в данном участке происходит транскрипция. В месте пуффа, вызванного действием экдизона, не наблюдается увеличения содержания гистонов или ДНК, в то время как содержание НГБ почти удваивается. Пуффы образуются лишь после окончания определенной стадии развития, когда клетки становятся компетентными (17-дневные личинки); они не появляются у 4-дневных личинок. Это свидетельствует о том, что для действия экдизона необходим какой-то цитоплазматический фактор, вероятно белок. Следовательно, прежде чем экдизон сможет оказать воздействие на специфические гены, должен быть активирован определенный ген, ответственный за синтез этого белка. При возникновении пуффов в политенных хромосомах Drosophila отношение белков к ДНК увеличивается с 6 до 16, количество РНК увеличивается вдвое, а Т m данного участка понижается на 10 °C . Кроме того, около пуффов накапливаются НГБ. В содержании ДНК и гистонов, связан дается никаких изменений, а большая часть гистонов, связанных с ДНК, оказывается дестабилизированной. Эти наблюдения подтверждаются результатами, полученными с помощью иммунофлуоресценции, согласно которым пуффы, индуцированные в политенных хромосомах Drosophila тепловым ударом, содержат новые НГБ. Очевидно, НГБ ответственны за активацию генов.

Воздействие НГБ на экспрессию специфических генов изучалось рядом исследователей . Когда НГБ клеток HeLa добавляли к хроматину этих клеток в фазе G 1 , начиналась транскрипция генов гистонов, хотя обычно в этой фазе их экспрессии нет. При воссоединении хроматина в S-фазе клеток W1-38 с S-фазными НГБ наблюдается 500-кратная стимуляция транскрипции генов гистонов, в то же время при воссоединении хроматина печени мыши с S-фазными НГБ клеток HeLa транскрипции генов глобина не происходит. Эксперименты по реконструкции с использованием хроматина эритроцитов цыпленка показали: для того чтобы вызвать транскрипцию генов глобина, определенная фракция НГБ должна связываться с ДНК раньше, чем с гистоном . После того как удалось разделить хроматин клеток тимуса теленка и костного мозга на ДНК, гистоны и НГБ, полученные компоненты были использованы в опытах по реконструкции . Оказалось, что в случае клеток тимуса синтезированные РНК похожи на РНК тимуса, а мРНК глобина не синтезируются. Когда же был реконструирован и использован для транскрипции хроматин костного мозга, мРНК глобина синтезировались. Вместе с тем если в реконструкции участвовали ДНК и гистон тимуса и НГБ костного мозга, то также происходил синтез мРНК глобина. Отсюда следует, что НГБ, вероятно, участвуют в регуляции специфических генов. В культуре клеток мышц НГБ активно фосфорилируются главным образом во время дифференцировки . Установлено также, что НГБ принимают участие в положительном контроле экспрессии генов. Однако для того, чтобы идентифицировать специфические компоненты НГБ, участвующих в контроле, и установить точный механизм контроля, необходимы дальнейшие исследования.

Рассмотрим функции негистоновых белков, их значение для организма. Данная тема представляет особый интерес, заслуживает детального изучения.

Главные белки хроматина

Гистоновые и негистоновые белки непосредственно связаны с ДНК. Ее роль в составе интерфазных и митотических хромосом довольно велика - хранение и распространение генетической информации.

При осуществлении подобных функций необходимо обладать четкой структурной базой, позволяющей располагать длинные молекулы ДНК в четком порядке. Подобное действие позволяет контролировать периодичность протекания синтеза РНК,

Ее концентрация в интерфазном ядре составляет 100 мг/мл. На одно ядро млекопитающих приходится примерно 2 м ДНК, локализуемой в сферическом ядре диаметром порядка 10 мкм.

Группы белков

Несмотря на многообразие, принято выделять две группы. Функции гистоновых и негистоновых белков имеют определенные отличия. Около 80 процентов всех белков хроматина составляют гистоны. Они взаимодействуют с ДНК за счет ионных и солевых связей.

Несмотря на значительное количество, гистоны и негистоновые белки хроматина представлены несущественным разнообразием белков, в эукариотических клетках содержится порядка пяти-семи типов молекул гистона.

Негистоновые белки в хромосомах в основном специфичны. Они взаимодействуют только с определенными структурами молекул ДНК.

Особенности гистонов

Каковы функции гистоновых и негистоновых белков в хромосоме? Гистоны связываются в виде молекулярного комплекса с ДНК, они являются субъединицами такой системы.

Гистоны являются белками, характерными лишь для хроматина. Они имеют определенные качества, позволяющие им выполнять специфические функции в организмах. Это щелочные или основные белки, характеризующиеся достаточно высоким содержанием аргинина и лизина. Благодаря положительным зарядам на аминогруппах обусловливается электростатическая или солевая связь с противоположными зарядами на фосфатных структурах ДНК.

Такая связь является довольно лабильной, она легко разрушается, при этом происходит диссоциация на гистоны и ДНК. Хроматин считается комплексом, внутри которого есть высокополимерные линейные молекулы ДНК, а также значительное количество молекул гистонов.

Свойства

Гистоны являются достаточно небольшими белками по молекулярной массе. Они имеют сходные свойства у всех эукариот и обнаруживаются сходными классами гистонов. К примеру, виды H3 и H4 причисляют к богатым аргинином, так как в их составе достаточное количество данной аминокислоты.

Разновидности гистонов

Такие гистоны считают консервативными, так как последовательность аминокислоты в них сходна даже у отдаленных видов.

H2A и H2B считают белками, в которых умеренное содержание лизина. Разные объекты внутри данных групп имеют некоторые вариации в первичной структуре, а также в последовательности расположения аминокислотных остатков.

Гистон H1 является классом белков, в которых аминокислоты располагаются в сходной последовательности.

У них обнаруживаются существеннее межтканевые и межвидовые вариации. В качестве общего свойства рассматривается значительное количество лизина, в результате чего именно эти белки можно отделять от хроматина в разбавленных солевых растворах.

Гистоны всех классов характеризуются кластерным распределением основных аминокислот: аргинина и лизина на концах молекул.

H1 отличается вариабельным N-концом, осуществляющим взаимосвязь с иными гистонами, а С-конец обогащен лизином, именно он вступает во взаимодействие с ДНК.

При жизнедеятельности клеток возможны модификации гистонов:

• метилирование;
• ацетилирование.

Подобные процессы приводят к изменению количества положительных зарядов, они являются обратимыми реакциями. При фосфорилировании сериновых остатков появляется избыточный отрицательный заряд. Такие модификации влияют на свойства гистонов, их взаимодействие с ДНК. Например, при ацетилировании гистонов наблюдается активация генов, а дефосфорилирование вызывает деконденсацию и конденсацию хроматина.

Особенности синтеза

Процесс происходит в цитоплазме, далее происходит транспортировка в ядро, связывание с ДНК при ее репликации в S-периоде. После прекращения синтеза клеткой ДНК в течение нескольких минут происходит распад информационных гистоновых РНК, процесс синтеза прекращается.

Подразделение на группы

Выделяют разные виды негистоновых белков. Деление их на пять групп является условным, оно основывается на внутреннем сходстве. Существенное количество отличительных свойств выявлено у высших и низших эукариотических организмов.

К примеру, вместо H1, характерного для тканей низших позвоночных организмов, обнаруживают гистон H5, который содержит большее количество серина и аргинина.

Встречаются и ситуации, связанные с частичным либо полным отсутствием у эукариот гистонных групп.

Функциональные возможности

Подобные белки были найдены в составе бактерий, вирусов, митохондрий. Например, у E. coli в клетке найдены белки, аминокислотный состав которых аналогичен гистонам.

Негистоновые белки хроматина выполняют важные функции в живых организмах. До выявления нуклеосом использовали две гипотезы, касающиеся функционального значения, регуляторной, структурной роли таких белков.

Удалось обнаружить, что при добавлении к выделенному хроматину РНК-полимеразы получается матрица для процесса транскрипции. Но активность его оценивается только в 10 процентов от аналогичного показателя для чистой ДНК. Она возрастает при удалении групп гистонов, а при их отсутствии составляет максимальную величину.

Это свидетельствует о том, что суммарное содержание гистонов позволяет контролировать процесс транскрипции. Качественное и количественно изменение гистонов оказывает влияние на активность хроматина, степень его компактности.

Не до конца изучен вопрос, касающийся специфичности регуляторных характеристик гистонов во время синтеза специфичных и-РНК в разных клетках.

При постепенном добавлении фракции гистонов к растворам, содержащим чистую ДНК, наблюдается выпадение осадка в виде комплекса ДНП. При выведении из раствора хроматина гистонов происходит полный переход в растворимое основание.

Функции негистоновых белков не ограничиваются построением молекул, они намного сложнее и многограннее.

Структурное значение нуклеосом

В первых электромикроскопических и биохимических работах было доказано, что в препаратах ДПН есть нитчатые структуры, диаметр которых находится в интервале 5-50 нм. По мере совершенствования представлений о молекул удалось выяснить, что существует прямая зависимость между диаметром фибрилла хроматина и способом выделения препарата.

На тонких срезах митотических хромосом и интерфазных ядер после выявления были обнаружены хроматированные фибриллы, толщина которых составляет 30 нм.

Аналогичными размерами обладают фибриллы хроматина в случае физической фиксации их ядер: при замораживании, скалывании, взятии реплик с подобных препаратов.

Негистоновые белки хроматина были открыты двумя различными способами нуклеосом-частиц хроматина.

Исследования

При осаждении препаратов хроматина на подложку для электронной микроскопии в щелочных условиях при несущественной ионной силе получаются нити хроматина, похожие на бусы. Их размер не превышает 10 нм, а глобулы связаны между собой отрезками ДНК, длина которых не превышает 20 нм. В ходе наблюдений удалось установить связь между структурой ДНК и продуктами распада.

Негистоновые белки составляют порядка двадцати процентов белков хроматина. Они являются белками (кроме тех, что выделяются хромосомами). Негистоновые белки - это комбинированная группа белков, которые между собой отличаются не только по свойствам, но и по функциональной важности.

Большая часть их относится к белкам ядерного матрикса, которые обнаруживаются и в составе интерфазных ядер, и в митотических хромосомах.

Негистоновые белки могут включать порядка 450 индивидуальных полимеров, имеющих различную молекулярную массу. Некоторые из них растворимы в воде, есть и такие, которые растворимы в кислых растворах. Из-за непрочности связи с хроматином протекающей диссоциации при наличии денатурирующих агентов возникают существенные проблемы с классификацией и описанием данных белковых молекул.

Негистоновые белки - это регуляторные полимеры, стимулирующие транскрипцию. Есть и ингибиторы данного процесса, которые связываются в специфической последовательности на ДНК.

К негистоновым белкам могут относиться и ферменты, принимающие участие в метаболизме нуклеиновых кислот: метилазы РНК и ДНК, ДНКазы, полимеразы, белки хроматина.

Среда множества подобных полимерных соединений максимально изученными считают негистоновые белки, обладающие высокой подвижностью. Для них свойственна неплохая электрофоретическая подвижность, экстрагирование в растворе поваренной соли.

HMG-белки представлены в четырех видах:

• HMG-2 (м.в. = 26 000),
• HMG-1 (м.в. = 25 500),
• HMG-17 (м.в. = 9247),
• HMG-14 (м.в. = 100 000).

В живой клетке таких структур содержится не больше 5 % от суммарного количества гистонов. Они особенно распространены в активном хроматине.

Белки HMG-2 и HMG-1 не включены в состав нуклеосом, они связываются только с линкерными фрагментами ДНК.

Белки HMG-14 и HMG-17 способны связываться с сердцеподобными полимерами нуклеосом, в результате чего происходит изменение уровня сборки фибрилл ДНП, они будут более доступны для реакции с РНК-полимеразой. В подобной ситуации HMG-белки выполняют роль регуляторов транскрипционной активности. Удалось выявить, что фракция хроматина, которая обладает повышенной чувствительностью к ДНКазе I, насыщена HMG-белками.

Заключение

Третьим уровнем структурной организации хроматина являются петлевые домены ДНК. В ходе исследований было установлено: только при расшифровке принципа хромосомных элементарных компонентов сложно получить полное представление о хромосомах в митозе, в интерфазе.

Уплотнение ДНК в 40 раз получают благодаря максимальной спирализации. Этого недостаточно для того, чтобы получить реальное представление о размерах и характеристиках хромосом. Можно сделать закономерный вывод о том, что должны быть еще более высокие уровни сборки ДНК, с помощью которых можно было бы однозначно дать общую характеристику хромосомам.

Ученым удалось обнаружить подобные уровни организации хроматина в результате его искусственной деконденсации. В подобной ситуации специфические белки будут связываться с некоторыми участками ДНК, имеющими в местах объединения домены.

Принцип петлевой упаковки ДНК был обнаружен и у эукариотических клеток.

Например, если провести обработку выделенных ядер раствором поваренной соли, будет сохранена целостность ядра. Подобная структура стала называться нуклеотидом. Его периферия включает в себя значительное количество замкнутых петель ДНК, средний размер которых составляет 60 т.п.н.

При препаративном выделении хромомеров, последующем экстрагировании гистонов из них под электронным микроскопом будут видны петлистые розеткообразные структуры. Число петель в одной розетке составляет от 15 до 80, суммарная длина ДНК доходит дл 50 мкм.

Представления о строении и основных функциональных характеристиках белковых молекул, полученные в ходе экспериментальной деятельности, позволяют ученым вести разработку лекарственных препаратов, создавать инновационные методики эффективной борьбы с генетическими заболеваниями.

ГИСТОНЫ, белки эукариот, ответственные за упаковку ДНК в клеточном ядре; отличаются высоким содержанием положительно заряженных аминокислотных остатков - лизина и аргинина (до 30% аминокислот молекулы). На долю гистонов приходится основная часть белков хромосом; они формируют структуру хроматина и участвуют в контроле регуляции активности генов. Впервые были выделены из ядер эритроцитов гусей А. Косселем (1884).

Исходя из относительного содержания остатков лизина и аргинина различают пять основных типов гистонов: богатый лизином Н 1 или Н 5 (у животных, имеющих ядерные эритроциты), умеренно богатые лизином Н 2 А и Н 2 В и богатые аргинином Н 3 и Н 4 (Н - от английского Histon). Все гистоны относятся к числу наиболее консервативных по первичной структуре белков, что свидетельствует о том, что они наилучшим образом приспособлены к выполнению своих функций. Особенно это характерно для гистонов Н 3 и Н 4 , аминокислотные последовательности которых одинаковы почти у всех эукариот. Например, первичная структура гистонов Н 4 у таких филогенетически далёких организмов, как горох (проростки) и бык (тимус телёнка), различаются только двумя равнозначными заменами (валина на изолейцин и лизина на аргинин). Наименее консервативный гистон - Н 1 . Гистоны синтезируются в цитоплазме (этот процесс предшествует репликации ДНК), после чего транспортируются в ядро, где связываются с ДНК. Молекулярная масса 11 000-21 000, причём гистоны Н 1 примерно в два раза крупнее остальных. В клетке может присутствовать несколько вариантов гистонов одного и того же типа (кодируются отдельными генами). Они различаются аминокислотными заменами, вставками и делениями как отдельных аминокислот, так и целых фрагментов (доменов) в составе молекулы (последнее особенно характерно для гистонов Н 2 А и Н 2 В). Гистон Н 1 , например, представлен 1-6 вариантными формами. Замена гистонов на их варианты имеет фундаментальное значение для процессов, происходящих в ядре, в том числе при эмбриогенезе, в процессе дифференцировки клеток и тканей.

На основании структурно-функциональных особенностей гистонов в составе хроматина различают гистоны нуклеосомного кора и линкерные гистоны. Гистоны Н 2 А, Н 2 В, Н 3 и Н 4 , обнаруживаемые в клетке в эквимолярных количествах, образуют группу гистонов нуклеосомного кора. Они участвуют в формировании основной структурной единицы хроматина - нуклеосомы, обеспечивая максимальную компактизацию ДНК при сохранении полного и избирательного доступа к ней. Так, например, линейный размер молекулы ДНК в клетке человека достигает почти двухметровой длины, тогда как диаметр ядра, в котором эта ДНК упакована, не превышает 0,01 мм. В центральных, наиболее консервативных участках молекул гистонов нуклеосомного кора преобладают гидрофобные аминокислоты, необходимые для взаимодействия гистонов между собой (гистоны по парам «узнают» друг друга). В результате образуются гетеродимеры, которые, в свою очередь, формируют октамер, состоящий из тетрамера гистонов Н 3 - Н 4 и двух димеров Н 2 А - Н 2 В. Вокруг гистонового октамера происходит закручивание сегмента спирали ДНК таким образом, что расположенные на его поверхности аргининовые остатки, обращённые к ДНК, обеспечивают электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными группами ДНК. При этом происходит жёсткая фиксация ДНК (вне зависимости от нуклеотидной последовательности) и образуется универсальная структура нуклеосомы.

К линкерным относятся гистоны Н 1 и Н 5 . Они связываются с межнуклеосомными сегментами ДНК (так называемая линкерная ДНК), обеспечивая стягивание нитей ДНК на входе и выходе из нуклеосом. Роль линкерных гистонов состоит в упаковке нуклеосом в структуры более высокого порядка. На две молекулы каждого из гистонов нуклеосомного кора приходится одна молекула линкерного гистона.

Положительно заряженные остатки в молекулах гистонов локализованы преимущественно в N- и С-концевых участках, которые обычно располагаются над поверхностью хроматиновых фибрилл. Эти участки подвергаются многочисленным посттрансляционным модификациям: ацетилированию, фосфорилированию, метилированию, АДФ-риболизированию, связыванию с белком убиквитином и др. Всё это приводит к изменению заряда, гидрофобности и других свойств молекул гистонов. Разнообразный набор модификаций N- и С-концевых доменов гистонов на поверхности нуклеосом составляет часть так называемого гистонового кода. Другим его элементом являются вариантные формы гистонов «Гистоновый код» является основным эпигенетическим механизмом (не затрагивающим информации, записанной в ДНК), который контролирует включение и выключение генов и передачу программы этого контроля от клетки к клетке в процессе их деления (митоза).

В нуклеоидах бактерий присутствуют белки, сходные с эукариотическими гистонами (гистоноподобные белки). Они способны конденсировать ДНК, но ничего похожего на нуклеосомы не образуют.

Лит.: Wu R. S., Panusz Н. Т., Hatch С. L., Bonner W. М. Histories and their modifications // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1986. Vol. 20. № 2; Льюин Б. Гены. М., 1987. Гл. 23, 29.

Белки - непериодические полимеры, мономерами которых являются аминокислоты.Все белки представляют собой полимеры, состоящие из длинных цепей субъединиц, соединенных вместе в линейную структуру. Субъединицы - это 20 разных аминокислот.Общим признаком для всех аминокислот является наличие в их составе карбоксильной и аминогрупп, соединенных атомом углерода. Кроме этих общих атомов, каждая аминокислота содержит свои особые боковые цепи, присоединенные к центральному атому углерода. Таким образом, хотя все аминокислоты принадлежат к одному классу соединений и имеют некоторые общие химические свойства, отдельные аминокислоты резко отличаются друг от друга.

Уровни структурной организации

В строении молекул белков различают 4 уровня организации:

· Первичная структура - полипептидная цепь из аминокислот, связанных в определенной последовательности ковалентными пептидными связями;

· Вторичная структура - полипептидная цепь в виде спирали. Между пептидными связями соседних витков и другими атомами возникают многочисленные водородные связи, обеспечивающие прочную структуру;

· Третичная структура - специфическая для каждого белка конфигурация - глобула. Удерживается малопрочными гидрофобными связями или силами сцепления между неполярными радикалами, которые встречаются у многих аминокислот.

· Четвертичная структура возникает при соединении нескольких макромолекул, образующих агрегаты. Так, гемоглобин крови человека представляет агрегат из четырех макромолекул.

Нарушение природной структуры белка называют денатурацией. Она возникает под воздействием высокой температуры, химических веществ, лучистой энергии и др. факторов.

Биологическая роль белков

· Строительная (структурная) функция: белки - строительный материал организма (оболочки, мембраны, органоиды, ткани, органы);

· Каталитическая функция - ферменты, ускоряющие реакции в сотни миллионов раз;

· Опорно-двигательная функция - белки, входящие в состав костей скелета, сухожилий; движение жгутиковых, инфузорий, сокращение мышц;

· Транспортная функция - гемоглобин крови;

· Защитная - антитела крови обезвреживают чужеродные вещества;

· Энергетическая функция - при расщеплении белков 1 г освобождает 17,6 кДж энергии;

· Регуляторная и гормональная - белки входят в состав многих гормонов и принимают участие в регуляции жизненных процессов организма;

· Рецепторная - белки осуществляют процесс избирательного узнавания отдельных веществ и их присоединение к молекулам.

Понятие о гистоновых и негистоновых белках

Гистоны - обширный класс ядерных белков, выполняющих две основные функции: они участвуют в упаковке нитей ДНК в ядре и во вторичной регуляции таких ядерных процессов, как транскрипция, репликация и репарация, проявляют сильно оснóвные свойства.

Негистоновые белки - это все белки хроматина, кроме гистонов, выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. Около 80% из негистоновых белков относится к белкам ядерного матрикса, обнаруживаемых как в составе интерфазных ядер, так и митотических хромосом. Гистоновые и негистоновые белки принимают участие в экспрессии генов, участвуют в создании структуры молекулы ДНК. Гистоновые белки - факторы репрессии (блокирования) генов, негистоновые - наоборот способствуют считыванию информации. Взаимодействие гистоновых и негистоновых белков – механизм блокирования и разблокирования молекулы ДНК.

Прионовые белки и их медицинское значение.

Прионы – модифицированные прионовые белки (содержат > 50 полиглютаминовых фрагментов). Прионовые белки – нейромедиаторы и регуляторы циркадных ритмов. Попадая в организм человека, прионы модифицируют (переделывают под себя) нормальные прионовые белки и вызывают следующие болезни: Куру, Кройцфельта-Якоба, смертельная семейная бессонница, Подострый спонгиозный трансмиссийный энцефалит и проч. Способы «заражения»: спонтанное возникновение в мозге прионов, ятрогения, наследственность, употребление в пищу «зараженного» мяса

9.Нуклеиновые кислоты. ДНК, её состав и структурная организация,

локализация в клетке. Биологическая роль.

Нуклеиновые кислоты - природные высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу наследственной (генетической) информации в живых организмах.

В природе существуют нуклеиновые кислоты двух типов, различающиеся по составу, строению и функциям. Одна из них содержит углеводный компонент дезоксирибозу и названа дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). Другая содержит рибозу и названа рибонуклеиновой кислотой (РНК).

ДНК, её состав

ДНК представляет собой двухцепочечный биологический полимер, мономерами которого являются нуклеотиды, содержащие одно из азотистых оснований, дезоксирибозу и остаток фосфорной кислоты. Нуклеотиды ДНК: пуриновые основания аденин (А) и гуанин (Г) и пиримидиновые основания цитозин (Ц) и тимин (Т).

структурная организация

Полинуклеотидные цепи молекулы ДНК антипараллельны и соединены друг с другом водородными связями по принципу комплиментарности в двойную спираль.

локализация в клетке

ДНК находится в ядре клетки в виде комплекса с ядерными белками (гистонами).
Еще есть своя особенная (кольцевая) ДНК в митохондриях (мтДНК) и в хлоропластах у растений (хлДНК). У бактерий ядра нет, поэтому и ДНК свободно плавает в цитозоле (внутриклеточная жидкость, матрикс цитоплазмы).

Биологическая роль

Функция у ДНК одна - хранение генетической информации.

Похожая информация.

Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 10 3 --1 х 10 4 . И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.

В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки . На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.

Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом . До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.

Гистоны – белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких основных аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в этом случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. Поэтому хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).

Гистоны – наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5).

Таблица 5 . Общие свойства гистонов млекопитающих

Гистоны – относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных основных аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).

Два других гистона H2A и H2B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.

Гистон H1, представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. Однако их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.

Для гистонов всех классов (особенно для H1) характерно кластерное распределение основных аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах молекул. Срединные участки молекул гистонов образуют несколько (3-4) -спиральных участка, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-видимому, богатые положительными зарядами неспирализованные концы белковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК.

У гистона H1 наиболее вариабельным является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а C-конец, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.

В процессе жизнедеятельности клеток могут происходить посттрансляционные изменения (модификации) гистонов: ацетилирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов может быть обратимым. Эти модификации значительно меняют свойства гистонов, их способность связываться с ДНК. Так повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и деконденсацией хроматина.

Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде, т.е. синтез гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гисонов останавливается. Включившиеся в хроматин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.

Подразделение гистоноы на пять групп и достаточное сходство их внутри каждой группы в целом характерно для эукариот. Однако целый ряд отличий в составе гистонов наблюдается как у высших, так и у низших эукариотических организмов. Так у низших позвоночных вместо H1, характерного для всех тканей этих организмов, в эритроцитах находят гистон H5, который содержит больше аргинина и серина. С другой стороны, наблюдается отсутствие некоторых групп гистонов у ряда эукариот, и в целом ряде случаев полная замена этих белков на другие.

Гистоноподобные белки были обнаружены в составе вирусов, бактерий, митохондрий. Так, например, у E. coli в клетке в большом количестве обнаруживаются белки (HU и H-NS), по аминокислотному составу напоминающие гистоны.

Функциональные свойства гистонов

Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отдаленных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом, все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга группы гипотез о функциональной роли гистонов, о регуляторной и структурной их роли.

Было обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-полимеразы может быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности выделенной чистой ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда можно было сделать вывод, что общее содержание гистонов может регулировать уровень транскрипции. Это наблюдение совпадает с тем, что по мере удаления гистонов, особенно H1, происходит прогрессивная деконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчает взаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено, что модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашивается вывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. Однако оставался открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках. Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как H1 или как H2A и H2B, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.

Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов в организации хроматина. Так постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к его переходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит к образованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующей роли гистонов. Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНК уложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров, молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностью упаковки равной 1: 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНК существуют несколько уровней упаковки, первые из которых прямо определяются взаимодействием гистонов с ДНК.

Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосом

В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.

На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гистонов в хроматиновых фибриллах.

Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так при осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматина представляли собой что-то, напоминающее “бусы на нитке”: небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм (рис. 57, 58). Эти наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания.

Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиеся структуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой, состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезки в 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, что нуклеазной атаке в составе хроматина подвергаются участки ДНК, расположенные примерно через каждые 200 п.н. При этом в кислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2% ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростью седиментации 11S (S - единица Сведберга, определяющая скорость седиментации частиц, равна 1 х 10 -13 с), а также частицы кратного этой величине размера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. Оказалось, что частицы 11S содержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер ) по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы . Более подробный анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто в нашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица), по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белками сердцевины - линкер , который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной, сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. - участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1 (рис. 59). Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 х 10 9 пар оснований) приходится 1,5 х 10 7 нуклеосом.

Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) очень консервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамер гистонов. Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н. на нуклеосому).

Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точные размеры нуклеосом. При грубом приближении – это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования они образуют «бусины», глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3  H4) 2 и два независимых димера H2A  H2B. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.

В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спираль ДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При этом за счет дополнительной спирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому) происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.

Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя последовательность добавления гистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это может быть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что для образования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании уже готовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровней компактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны H3 и H4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3  H4) 2 к которому позжеприсоединяются два димера H2A  H2B. Вероятно, высокая консервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образовании нуклеосом.